Grusel! Scooby-Doo und die Mitglieder der Mystery Inc. Fred (Freddie Prinze Jr.), Daphne (Sarah Michelle Gellar), Shaggy (Matthew Lillard) und Velma (Linda Cardellini) werden auf die super-coole Vergnügungsinsel "Scooby Island" gerufen. Der Besitzer Emile Mandavarious (Rowan Atkinson) bittet die fünf Freunde, eine Reihe übernatürlicher Zwischenfälle aufzuklären. Sie sollen diesen Fall lösen, noch bevor die mysteriösen Geheimnisse an die Öffentlichkeit gelangen und die Besucher vergraulen. Bei diesem Abenteuer müssen Scooby und seine Freunde allerdings alles vergessen, was sie bisher über falsche Geister und fiese Dämonen zu wissen meinten. Doch mit kriminalistischem Scharfsinn und viel Mut retten sie am Ende nicht nur sich selbst, sondern vielleicht auch ... die Welt! Huuhhhaaa!
Schock! Panik! Die berühmten Spürnasen verlieren ihre Fassung und ihren guten Ruf, denn ein maskierter Unbekannter erschafft mit seiner Monstermaschine die klassischen Gegner der Detektive neu und lässt sie auf die Stadt Coolsville los: Captain Cutlers Geist, das 10.000-Volt-Monster, das Pterodaktylus-Gespenst und das Gespenst des Schwarzen Ritters.
Die hartgesottene Reporterin Heather Jasper-Howe, behauptet nun, das berühmte Detektivteam schütze die panischen Bürger der Stadt nicht so gewissenhaft, wie man bisher angenommen hat. Dadurch geraten die Freunde unter Druck. Sie untersuchen die rätselhafte Monsterattacke, wobei sich Shaggy and Scooby bald fragen, was sie im Team eigentlich noch zu suchen haben.
Deshalb will das ständig hungrige Duo es diesmal allen zeigen und den Fall ganz selbstständig lösen. In irrwitzigen Verkleidungen ermitteln sie allein. Höchst verdächtig erscheint Jeremiah „Old Man“ Wickles, der einstige Geist des Schwarzen Ritters, den die Freunde damals enttarnt und hinter Gitter gebracht haben. Hat dieser gruselige Gernegroß den Monsterangriff angezettelt, um sich auf teuflische Art zu rächen?
Unterdessen verknallt sich die pfiffige Velma in einen weiteren Hauptverdächtigen, den Kurator des Coolsonian-Museums für Kriminologie, Patrick Wisely, während Macho-Anführer Fred und die sehr auf ihr Image bedachte Daphne jenen schurkischen Maskierten identifizieren wollen, dessen Monsterarmee in Coolsville keinen Stein auf dem anderen lässt.
Wie wird man zu besten Freunden? Bei Daphne, Velma, Fred, Shaggy und Shaggys ängstlichem Hund Scooby-Doo ist es ein mysteriöses Abenteuer! Scoobys neuester Live Action-Spielfilm führt uns zurück zu dem Zeitpunkt als die vier Jungdetektive (plus einem Hundedetektiv) sich kennen lernen. Zu Unrecht werden die vier Kids beschuldigt in ihrer Schule, der Coolsville High, einen mysteriösen Spuk mit „echten“ Gespenstern inszeniert zu haben. Als sie dafür sogar von der Schule verwiesen werden, beschließen die neuen Freunde gemeinsam dem geheimnisvollen Spuk auf den Grund zu gehen … und steuern direkt in eine abenteuerliche und urkomische Handlung.